Milli genbankda saxlanılan yumşaq buğda numunələrinin gen spesifik markerlər əsasında genotipləşdirilməsi

Buğda, illik məhsul istehsalı 650 milyon ton təşkil etməklə, qarğıdalı bitkisindən sonra ən çox əkilən dənli bitkidir. Dünya üzrə kənd təsərrüfatına yararlı torpaqların 25%i  buğda bitkisinin becərilməsi üçün istifadə edilir. Əhalinin buğdaya olan tələbatının ödənilməsi üçün buğda bitkisinin məhsuldarlığı hər il 2% artmalı olduğu halda, bu göstərici 1%-dən də aşağıdır Əkinə yararlı torpaq sahələrinin artırılması imkanı məhdud olduğundan, məhsuldarlığın yüksəldilməsi vahid sahədən olan məhsulun artırılması hesabına əldə edilə bilər. Dən məhsuldarlığının, biotik və abiotik stresə davamlılığın, dayanıqlı məhsuldarlığın, keyfiyyət göstəricilərinin artırılması buğda seleksiyasının ən əsas məqsədlərindəndir.
Yaşıl İnqilabın nəticəsi olaraq yaradılmış buğda sortları sudan effektli istifadə, gübrə tətbiqinə qarşı müsbət reaksiya vermək baxımından çox yaxşı göstəricilərə malik olmuş və  uzun illər təsərrüfatlarda uğurla istifadə olunmuşdur. Lakin hazırda su ehtiyatları tükənməkdədir, gübrələrin istifadəsi isə bəzi ərazilərdə artıq çoxdan mümkün olan normanı aşmışdır. Odur ki, yeni Yaşıl İnqilab müasir biotexnoloji və molekulyar genetik üsullara dayanmaqla, mövcud resurslardan daha səmərəli istifadə etməlidir. Müasir bitki seleksiyası təkmilləşdirilmiş fenotipləşdirmə və genotipləşdirmə üsullarının tətbiqindən əhəmiyyətli dərəcədə asılıdır. Marker əsaslı seleksiya bir qədər yeni və effektli yanaşma olmaqla, arzu olunan genom lokuslarının müəyyənləşdirilməsi və piramidalama yolu ilə bu lokusların bir genotipdə cəmləşdirilməsi üçün yeni imkanlar yaradır.  Molekulyar markerlər arasında tək nukleotid polimorfizmi (TNP) son nəsil markerlər qrupuna aid olmaqla molekulyar seleksiya və genetika sahəsində çox geniş tətbiq edilir.
Yumşaq buğda (Triticum aestivum L.) bitkisinin də aid olduğu allopoliploid növlər diploid növlərə nisbətən daha mürəkkəb olub seleksiya işində müəyyən çətinliklər yaradır.  Yumşaq buğdanın heksaploid genomu bir çox genlərin 3 homeoloji nüsxəsi üzrə çox aşağı polimorfizm dərəcəsinə malik üç müxtəlif genomdan təşkil olunmuşdur. Odur ki, buğda bitkisində TNP markerlərinin aşkar edilməsi diploid və tetraplod növlərə nisbətən daha çətindir. Buğda taxıllar arasında ən az polimorfzmə malik genom kimi qiymətləndirilir; burada TNP-lərin rastgəlmə tezliyi arpaya nisbətən 2.3-3.1 dəfə aşağıdır.
Yüksək məhsuldar genotipləşdirmə metodlarının yaradılması ilə bitki genomlarından TNP-lərin əldə edilməsi və seleksiya proqramlarında alət kimi istifadəsi prosesi daha da sürətləndi. TNP markerlərinin istifadəsi üçün səmərəli və sürətli üsullardan biri KASP (Kompetitive Allele Specific PCR) texnologiyasıdır. KASP polimeraza zəncir reaksiyasının homogen, flüoresensiya-əsaslı genotipləşdirmə formasıdır. Texnologiya allel-spesifik oliqonukleotidlərin uzanması və siqnalın yaranması üçün flüoressens rezonans enerjininötürülməsinə əsaslanır. Unipleks KASP
texnologiyası multipleks üsullarla (məs., çip texnologiyası) müqayisədə çox sürətlidir - bir neçə saata onlarla TNP və İndel-dən (insersiya və delesiya) dəqiq (99.8%) nəticə almağa imkan verir. KASP texnologiyası valideyn populyasiyalarının QTL xəritələşdirilməsi, marker-əsaslı seleksiya və QTL dəqiq xəritəlşdirmə (fine mapping) sahəsində uğurla tətbiq olunur. Son illərdə buğda bitkisində məhsuldarlıq, keyfiyyət göstəriciləri, xəstəliklərə davamlılıqla əlaqəli QTL-lər (kəmiyyət əlamətləri lokusları) müəyyən təşkilatlar tərəfindən KASP TNP markerlərinə çevrilmiş və elmi ictimaiyyətin istifadəsinə verilmişdir. Bu markerlər vasitəsilə yüzlərlə nümunəni eyni anda onlarla TNP markerinə görə dəqiq və sürətli analiz etmək mümkündür.
Tədqiqat işində əsas məqsəd KASP texnologiyasından istifadə etməklə Milli genbankda  saxlanılan yumşaq buğda kolleksiyasının məhsuldarlıq, keyfiyyət göstəriciləri və xəstəliklərlə  bağlı 11 müxtəlif lokus üzrə skrininqini həyata keçirmək və gələcək seleksiya işlərində donor kimi istifadə olunacaq genotipləri müəyyənləşdirməkdir.
Material və metodika. Tədqiqat materialı kimi AMEA Genetik Ehtiyatlar İnstitutunun Milli Genbankından əldə olunmuş 166 yumşaq buğda nümunəsindən istifadə olunmuşdur. Nümunələrdən 35-i müxtəlif illərdə yaradılmış sortlar, qalanı isə respublikanın müxtəlif regionlardan toplanılmış, 3 il ərzində sahə şəraitində öyrənilərək biomorfoloji əlamətlərinə görə seçilmiş və növmüxtəlifliyi dəqiq təyin olunmuş sabit nümunələrdir.
Nümunələrdən DNT-nin ekstraksiyası CTAB protokolu ilə həyata keçirilmişdir. Genotipləşdirmə üçün istifadə olunmuş 11 KASP markeri LGC Genomics şirkəti tərəfindən  dizayn olunmuş və şirkətin təqdim etdiyi müvafiq protokol əsasında həyata keçirilmişdir.
Nəticələr və onların müzakirəsi. Seleksiya əhəmiyyətli istənilən əlamətin yaxşılaşdırılması həmin əlamətə görə geniş variasiyanın mövcudluğundan asılıdır. Bu əlaməti idarə edən genlərin müsbət allellərinin daşıyıcıları olan genotiplər potensial mənbə kimi birbaşa seleksiya  işlərinə cəlb oluna bilər. Yumşaq buğda kolleksiyasında qiymətli təsərrüfat əlamətlərinə görə variasiyanı qiymətləndirmək məqsədilə, KASP texnologiyasından istifadə etməklə, 11 gen üzrə genotipləşdirilmə həyata keçirilmiş, ayrı-ayrı və kompleks müsbət allellərə malik nümunələr seçilmişdir. Əldə olunmuş nəticələr  məhsuldarlıq, dənin keyfiyyəti və xəstəliklərə 
davamlılıq kateqoriyalarına bölünməklə təhlil edilmişdir.
Məhsuldarlıqla əlaqəli genlərin skrininqi. Bitkinin boyu, fotoperiodik qeyri-həssaslıq məhsuldarlıqla əlaqəli ən mühüm fenotipik əlamətlərdən sayılır. Rht (boyun qısalması) genləri cırtdanboyluluq və yüksək məhsuldarlıq fenotipi ilə əlaqədar olub 1935-ci ildə aşkar edilmiş və Yaşıl İnqilabdan sonra buğdaların seleksiyasında geniş şəkildə istifadə olunmuşdur. Buğda bitkisində çox sayda Rht genləri olsa da, yalnız üçü - Rht-B1 (Rht1), Rht-D1 (Rht2) və Rht8 genləri seleksiya işlərində geniş şəkildə istifadə olunur.Tədqiq edilən 166 yumşaq buğda genotipi arasından 43 nümunədə Rht-B1 geninin Rht-B1b, 5 nümunədə isə Rht-D1 geninin Rht-D1b mutant (cırtdanboyluluq) alleli aşkar edilmişdir. Bundan əlavə, 6 nümunənin Rht-B1, 4 nümunənin isə Rht- D1 geninə görə heteroziqot olması müəyyən edilmişdir. Rht-B1b alleli aşkar edilən nümunələr arasında Azərbaycanın müxtəlif bölgələrindən toplanmış növmüxtəliflikləri ilə yanaşı,Arzu, Qarabağ, Zərdabi, Əkinçi 84, Ruzi 84, Əzəmətli 95, Qobustan, Yeganə və s. kimi sortlar da yer almışdır. Sortlar arasında yalnız Günəşli sortunda Rht-D1b alleli qeydə alınmışdır. Ədəbiyyat məlumatlarına görə, qeyd olunan sortlar əsasən orta boylu və yatmaya qarşı davamlı olmaqla, bitkinin hündürlüyü 81-100 sm arasında dəyişmişdir. Boyun uzunluğuna görə ən aşağı göstərici (81-92 sm) Rht-D1b allelinə malik Günəşli sortunda qeydə alınmışdır. Digər yumşaq buğda sortnümunələrinin Rht-B1a və Rht-D1a hündür boyluluq allellərinə malik olması müəyyən edilmişdir. Sortların hündürlüyü 100 sm-dən yuxarı olmaqla, Uğur, Şəki 1, Azəri, Şəfəq 2 sortlarında 110-116 sm arasında dəyişmişdir. Məlumdur ki, Rht-B1b Rht-D1b mutant cırtdan- boyluluq allelləri hiberellinə qarşı qeyri-həssas olub, əlverişli mühit şəraitində məhsuldarlıq indeksinin və yatmaya qarşı davamlılığın yüksəlməsinə səbəb olur. Bununla belə, əlverişsiz şəraitlərdə (məs., quraqlıq) mutant allellərin mövcudluğu, həm də koleoptilin  uzunluğunun azalmasına və beləliklə, cücərtilərin zəif inkişafına və məhsul itkisinə də gətirib çıxara bilər. Əksinə, qeyd olunan mutant allellərin heç birinə malik olmayan hündür genotiplər koleoptilin uzunluğunu azaltmadığından dəmyə şəraitində becərilmə üçün daha münasibdir. Odur ki, Rht-B1b və 
Rht-D1b allelləri aşkar edilməmiş genotiplərin Respublikanın müxtəlif dəmyə bölgələrində becərilməsi daha məqsədəuyğun hesab edilə bilər. Bəzi ədəbiyyat məlumatlarına görə qeyd edilən iki mutant allelin birgə mövcudluğu məhsuldarlığın kəskin şəkildə azalmasına səbəb olur. Tədqiq olunan yumşaq buğda kolleksiyasında hər iki allelə malik genotiplər müşahidə olunmamışdır.
Yumşaq buğda sortlarının müxtəlif mühit şəraitinə adaptasiyası çiçəkləmə vaxtı ilə sıx əlaqədarolub fotoperiodizmə cavab reaksiyası 
genlərinin (Ppd) də daxil olduğu bir sıra genlər qrupu ilə idarə olunur. 2DS xromosomunda yerləşən Ppd-D1 geninin Ppd-D1a alleli buğda bitkisində fotoperiodik qeyri-həssaslığı və erkən çiçəkləməni, digər "ressesiv allel - Ppd-D1b" isə fotoperiodik həsaslığı təmin edir. Analizlər nəticəsində yumşaq buğda nümunələrinin yarıdan çoxunun 53%-nin fotoperiodik qeyri-həssas, 41.5%-nin isə həssas olduğu müəyyənləşdirilmiş, 9 nümunədə qeyd olunan lokusa görə heteroziqotluq müşahidə edilmişdir. Tədqiq edilən 35 sortdan 24-nün fotoperiodik qeyri-həssas, yerli Bol buğda, Pərzivan 1, Pərzivan 2 və s. kimi sortların isə həssas olduğu müşahidə olunmuşdur. Əldə olunan göstəricilər bir sıra əbədiyyat mənbələri ilə müqayisədə üstünlük təşkil edir. Guedira və b. (2010) 174 yumşaq buğda xətti ilə aparılmıştədqiqatlarda genotiplərin yalnız 32%-də Ppd-D1a alleli aşkar olunmuşdur.
Ppd-D1a və cırtdanboyluluq allellərinin birgə pleyotrop təsiri yüksək biokütlənin formalaşmasına müsbət təsir edir. Tədqiqatda fotoperiodik qeyri-həssaslıq allelinə malik 88 nümunədən üçünün həm də Rht- D1b, 31 genotipin isə Rht-B1b allelinə malik olması müəyyən edilmişdir. Müxtəlif illərdə yara- dılmış 10 seleksiya sortunun da daxil olduğu bu genotiplər kompleks müsbət əlamətlərə malik yeni sortların yaradılmasında uğurla istifadə edilə bilər.
Dənin keyfiyyət göstəriciləri ilə əlaqəli genlərin skrininqi. Buğda dəninin protein tərkibi və keyfiyyət göstəriciləri seleksiyada ən mühüm əlamətlərdən biri hesab edilir və müxtəlif fiziki, funksional, biokimyəvi üsullarla qiymətləndirilir. 
1-ci homeoloji xromosomun uzun çiynində yerləşən və ağır molekullu qlutenin subvahidlərini kodlaşdıran Glu-D1 geninin Glu-D1a alleli yumşaq buğdalarda geniş yayılmış və çorəkbişirmə keyfiyyətinə müsbət təsir göstərən parametrlərdən biridir. Tədqiqata cəlb olunmuş yumşaq buğda sort və nümunələrinin qeyd olunan genə görə skrininqi zamanı, ümumilikdə 34 genotipdə Glu-D1a alleli aşkarlanmış, 31 nümunənin bu allelə görə homoziqot, 
3-nün isə heteroziqot olması müəyyən edilmişdir. 31 genotipdən 7-si seleksiya sortları (Səba, Tale 38, Sianotrix 334/12, Arzu, Qarabağ, Zərdabi və Günəşli), qalanları isə əsasən var.alborubrum və var.erythrospermum növmüxtəlifliyinə aid genotiplərdir. Jin və həmkarları (2011)20 ölkədən olan 718 sortun Glu-A1 and Glu-D1 genləri ilə ilişikli markerlərlə skrininqi zamanı sortların 50%-nin Glu-A1b və ya Glu-D1d allelərinə malik olmasını müəyyən etmişdir.
Digər göstərici – dənin protein tərkibi (GPC) suyun absorbsiyasına və xəmirin formalaşma müddətinə təsir göstərdiyindən çörəkbişirmədə böyük əhəmiyyət kəsb edir. Bu əlamətə görə genetik variasiya az olduğundan, həmçinin GPC və dən məhsuldarlığı arasında mənfi korrelyasiya mövcud olduğundan bu problem yüksək GPC üzrə seleksiya prosesində bir qədər çətinlik yaradır. Tədqiqatımızda yalnız Ağdamdan toplanmış var.milturum növmüxtəlifliyinə aid 1  nümunədə yüksək protein tərkibi ilə əlaqəli allel aşkar edilmiş, qalan genotiplərin bu allelə görə neqativ olması müşahidə edilmişdir. Qeyd edilən genotip yüksək protein tərkibi üzrə seleksiya proqramlarında donor kimi istifadə oluna bilər.
Biotik stresə davamlılıq genlərinə görə skrininq. Əksər göbələk xəstəlikləri biotrof (məs, gövdə, yarpaq və sarı pas; unlu şeh və s.) və hemibiotrof (məs., qonur ləkəlilik, sarı ləkəlilik və sünbülün fuzariozu) patogenləri özündə cəmləşdirir. Bu günə qədər 71 yarpaq pası (Lr) və 57 gövdə pası (Sr) geni müəyyən edilmiş və seleksiya proqramlarında istifadə olunmuşdur. Lr 21 Lr 34 geni yetkin bitkilərin pas xəstəliyinə davamlılığını təmin edir. Qeyd olunan genlərin skrininqi nəticəsində nümunələrdə Lr 21 geni aşkar edilməmiş, bütün genotiplərin həssas olduğu müəyyən-ləşdirilmişdir. Bununla belə, 17 genotipin Lr 34 geninə görə davamlı olması, 33 genotipin isə heteroziqot vəziyyətdə davamlılıq genini daşıdığı aşkar edilmişdir. Sortlar arasında yalnız Səba və 
Günəşlidə Lr 34 davamlılıq geni qeydə alınmışdır. 17 nümunədən onunun var.alborubrum növmüxtəlifliyinə aid olması müəyyən edilmişdir. Qeyd olunan nümunələr seleksiya işlərində qonur pasa davamlılığın yaxşılaşdırılması üçün qiymətli mənbə kimi istifadə oluna bilər.
Pas göbələyi ştamlarının yüksək variasiyası onlara qarşı davamlılıq tədbirlərinin də zaman-zaman təkmilləşdirilməsini, yeni genlərin aşkarlanmasını, çox sayda davamlılıq geninə malik sortların yaradılmasını tələb edir. Gövdə pasına qarşı uzun müddətli davamlılığı təmin edən və ştam-spesifik olmayan yeganə gen Triticum turgidumssp.dicoccum (Schrank ex Schubler)Thell (Triticumdicoccum Schrank ex Schubler) növündən əldə olunmuş Sr2 genidir.  Kolleksiyanın Sr2 geninə görə skrininqi nəticəsində tədqiq olunan genotiplərin hamısının gövdə pası xəstəliyinə həssas olması aşkar edilmişdir.
Tədqiq olunan yumşaq buğda kolleksiyası biotrof patogenlərlə yanaşı, hemibiotrof sarı ləkəlilik (Tsn) və sünbülün fuzariozu (FHB) xəstəliklərinə davamlılığına görə də analiz olunmuş, müxtəlif nəticələr əldə edilmişdir.
Sünübülün fuzariozu xəstəliyinə davamlılıqla bağlı 1 neçə QTL müəyyən olunsa da əksər tədqiqatlar 3BS xromosomunda yerləşən Fhb1, 6BS xromosomundakı Fhb2 və 5 AS xromosumda yerləşən Fhb5 genlərinin daha önəmli olduğunu vurğulayır [28]. FHB 5A lokusunun skirininqinin nəticələri 47 genotipin bu lokusa görə davamlı, qalanlarının isə həssas olduğunu göstərmişdir. Onlardan 4 nümunədə qeyd olunan lokusa görə heteroziqotluq müşahidə  edilmişdir. Yerli və müxtəlif illərdə yaradılmış Bol buğda, Birlik, Gürgənə 1, Qızıl buğda və s. sortlarla yanaşı, yeni yaradılmış Start və Leyla sortlarının da davamlı olması müəyyən edilmişdir.
Lin və əməkdaşları (2006) FHB 5A lokusuna görə davamlı olan genotiplərin həssaslara  nisbətən 55% az sirayətləndiyini müşahidə etmiş, I tip davamlılıq qrupuna aid edilən bu lokusun xəstəlik üzrə fenotipik variasiyanın 16-27%-ni izah etdiyini təyin etmişlər.
II tip davamlılığı təmin edən Fhb1 geni FHB-nin sünbüldə yayılmasının qarşısını almaqla onun dən məhsuldarlığına təsirini effektli şəkildə azaltmağa imkan verir [30]. Tədqiq etdiyimiz kolleksiyada yalnız var.barbarossa növmüxtəlifliyinə aid 1 nümunədə Fhb1 geninin  müsbət (davamlılığı təmin edən) alleli aşkar edilmiş, digər 1 nümunənin isə (var.alborubrum - Ağsu) heteroziqot halda davamlılıq allelinə malik olması  müəyyənləşdirilmişdir. Ədəbiyyat məlumatlarında da bu genin pozitiv allelinin populyasiyalarda az rast gəlindiyi (2-10%) qeyd edilir. Sallam və əməkdaşları (2017) 53 yüksək məhsuldar buğda xəttinin KASP markerləri ilə skrininqi zamanı yalnız 3 genotipin qeyd olunan allelə malik olduğunu müşahidə etmişlər.Fhb1 geni FHB-yə uzun müddətli davamlılığı təmin etdiyindən buğda seleksiya proqramları üçün xüsusilə önəmlidir. Odur ki, qeyd olunan davamlılıq allelinə malik genotiplər seleksiya proqramlarında uğurla istifadə oluna bilər.
Mesterhazy (1995) öz tədqiqatlarında bitkinin boyu ilə FHB davamlılıq arasında neqativ korrelyasiyanın olduğunu göstərmişdir. Qeyd edilmişdir ki, cırtdanboyluluq genlərin özü-özlüyündə FHB simptomlarının daha güclü şəkildə təzahür etməsinə səbəb ola bilər. Bizim tədqiqatlarda da Rht-B1b cırtdanboyluluq allelinə malik 43 genotipdən 36-nın FHB-yə qarşı həssas olduğu müəyyən edilmişdir.
Sarı ləkəlilik xəstəliyinə davamlılıq genlərinin skrininqi kolleksiyadakı nümunələrin hamısının  həssas olduğunu göstərmişdir.
Beləliklə, 166 yumşaq buğda sort və növmüxtəlifliklərinin müxtəlif qiymətli təsərrüfat əlamətlərini idarə edən 11 lokus üzrə skrininqinin nəticələri kolleksiyada yeni qiymətli gen  mənbələrinin olduğunu deməyə əsas verir. 3 lokusu (Lr 21, Tsn Sr 2) çıxmaq şərtilə, qalan bütün genlər üçün seleksiya əhəmiyyəli allellərə malik genotiplər müəyənləşdirilmişdir. Tədqiq edilən 166 genotipdən, yalnız 20-də müsbət nəticələr əldə edilməmiş, qalan 146 nümunənin hər birində ən azı bir (homo- və ya heteroziqot halda) arzuolunan allelə təsadüf edilmişdir. Bu nümunələr buğda bitkisində donor kimi müxtəlif istiqamətli seleksiya işlərində məhsuldarlıq və davamlılıq əlamətlərinə görə genetik variasiyanı 
genişləndimək məqsədilə istifadə oluna bilər. 48  nümununənin 2, 14 nümunənin (o cümlədən 5 sortun) 3, 6 nümunənin isə eyni anda 4  müxtəlif alleli (homoziqot vəziyyətdə) özündə birləşdirməsi aşkar edilmişdir. 4 müsbət allelə  malik genotiplərdən biri Günəşli sortu, 4-ü var.alborubrum, 1-i isə var.meridionale növmüxtəlifliyinə aid genotiplərdir. Qeyd olunan sortnümunələr kompleks müsbət əlamətlərə malik genotiplər  kimi qiymətləndirilməklə, müxtəlif təsərrüfatlarda yüksək və keyfiyyətli məhsul alınması  məqsədilə becərilə və valideyn forma kimi çaprazlaşdırma işlərinə cəlb oluna bilər.